Aniontová chromatografie s pulzní amperometrickou detekcí (HPAEC-PAD)

Spojením aniontové chromatografie a pulzní amperometrické detekce vznikla analytická metoda, která nachází uplatnění při stanovení obsahu sacharidů v mnoha vzorcích různých původů, v jídle, nápojích, v mléce, ale také v rostlinných pletivech. Vysoká citlivost, selektivita a spolehlivost ji stavějí do první linie mezi analytickými metodami.


 

Princip metody

Díky této metodě lze stanovit i stopové koncentrace analytu v pikomolech. Výjimečnost HPAEC-PAD oproti ostatním metodám, jako například HPLC nebo GC, spočívá ve schopnosti separace multikomplexu složeného z monosacharidů, disacharidů a aminocukrů. Dalšími výhodami HPAEC jsou minimální příprava vzorků před samotným stanovením a detekce pouze těch sloučenin, které obsahují oxidovatelnou funkční skupinu, proto v tomto případě není nutná derivatizace. Kombinací pulzní amperometrické detekce a zlaté elektrody, jejíž povrch je vhodný pro katalýzu elektrooxidace aldehydické skupiny přítomné ve sloučeninách za vysokých hodnot pH, získáme selektivní a vysoce citlivý nástroj pro stanovení jak redukujících, tak i neredukujících sacharidů, alditolů, oligosacharidů a podobných látek, jako jsou methylované aldosy, deoxycukry, aminocukry, ale také cukerné kyseliny a N-acetylované aminocukry. Hojně se využívá v těchto oborech: biotechnologie, lékařství, zemědělství, potravinářství a ekologii (Lukszová, 2008).

Iontoměničové kolony

Iontoměničové kolony volíme jak podle charakteru stanovovaných látek, tak dle požadavků na separaci. Kolony se liší kapacitou iontové výměny, složením pryskyřice a zesítěním. Pro stanovení monosacharidů, disacharidů a některých oligosacharidů navrhla společnost Dionex Company všeobecně zaměřené kolony s názvem CarboPac™. Tyto kolony jsou plněné směsí obsahující polystyren a divinylbenzen. Jsou aglomerovány na latexu s kvartérní aminoskupinou MicrobeadTM (Anon., 1998). Microbead vykazuje vysokou stabilitu v rozmezí pH 0-14 a excelentní mechanickou stabilitu (Anon., 2000).

Kolona CarboPac™ PA10 je speciálně vyvinutá pro stanovení mono-, disacharidů a některých oligosacharidů, obsahuje více divinylbenzenu než PA1. Další iontoměničovou kolonou vhodnou pro stanovení mono- a oligosacharidů je CarboPac™ PA 100, která je plněná makroporézní pryskyřicí vzniklou z kopolymerace ethylvinyl- a divinylbenzenu. Obě zmíněné kolony CarboPac™PA1 a PA 100 jsou určené pro rychlou analýzu mono- a oligosacharidů. CarboPac™ PA1 se více uplatňuje při separaci monosacharidů a lineárních homopolysacharidů, zatímco PA 100 nachází větší uplatnění při analýze oligoasacharidů (Anon., 2000).

Speciálně pro stanovení cukerných alkoholů byla vyvinuta kolona CarboPac™ MA1, jejíž iontovýměnná kapacita je 45-krát větší než u PA1. Cukerné alkoholy jsou totiž slabší kyseliny než jejich neredukované protějšky, a proto byly slabě zadržovány na kolonách CarboPac™ PA1 a PA100. Při použití kolony MA1 jsou slabé anionty silněji vázány ke koloně, a tudíž je nutná vyšší koncentrace mobilní fáze, aby došlo k jejich eluci (Anon., 1997; Cataldi et al., 1997).

Náš chromatografický systém sestává z:

  • Kvartérní gradientové pumpy GS50 (Dionex Corporation, Sunnyvale, USA)
  • Elektrochemického detektoru ED50 (Dionex Corporation, Sunnyvale, USA), obsahující detekční celu se zlatou a referentní (srovnávací) elektrodou pH-Ag/AgCl, která minimalizuje šum základní linie
  • Autosampleru model 234 (Gilson, Francie)
  • Termostatu TCC-100 (Dionex Corporation, Sunnyvale, USA)
  • Vakuového odplyňovače (Dionex Corporation, Sunnyvale, USA)
  • Počítače se softwarem Chromeleon 6.3 firmy Dionex (Sunnyvale, USA)

Použitá literatura

    Anon. (1997): Determination of Sugar Alcohols in Confections and Fruit Juices by High-Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection. Dionex-Application Note 87.
    Anon. (1998): The Determination of Carbohydrates, Alcohols, and Glycols in Fermentation Broths. Dionex-Application Note 122, 1 -11.
    Anon. (2000): Analysis of Carbohydrates by High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAE-PAD). Dionex-Technical Note 20, 1-12.
    Cataldi T.R.I., Campa C., De Benedetto G.E., (2000): Carbohydrate analysis by high-performence anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection: The potential is still growing. Fresenius J. Anal Chem, 368: 739-758.
    Lukszová V. (2008): Diplomová práce, Ustav chemie a technologie sacharidů VŠCHT Praha, s. 11.